Zurita S1,2, Lopresti S2, Guasch LG1,3, Lannutti L1,3, Lanari Zubiaur J2, Pantuso FS1, Slavutsky I3, Stella F1,2,3
(1) Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales, Universidad de Morón; (2) Hospital Nacional Prof. Dr. A. Posadas; (3) Laboratorio de Genética de Neoplasias Linfoides, Instituto de Medicina Experimental (IMEX)/CONICET-Academia Nacional de Medicina. fla_stella@yahoo.com.ar
Introducción: El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia de células B, con amplia heterogeneidad, puede estar precedido por un estadio asintomático, la gammapatía monoclonal de significado incierto (MGUS). El estudio de las alteraciones genéticas en estos desórdenes ha permitido la definición de subgrupos específicos, y provisto las bases para la identificación de genes involucrados en la iniciación y progresión de estas entidades. El presente proyecto se encuentra orientado al análisis genético de muestras de pacientes con estos desórdenes, con especial interés en la búsqueda de alteraciones en los genes C-MYC y CD27. C-MYC participa en el crecimiento celular, proliferación y tumorigénesis, pudiendo ser su desregulación un indicador de progresión tumoral, en tanto que CD27 codifica para una proteína transmembrana que se expresa en linfocitos B. En pacientes con MM su menor expresión podría correlacionarse con estadios avanzados de la enfermedad. Cabe destacar que no existen estudios aún en nuestro medio focalizados en la detección específica de estas alteraciones. El objetivo del presente trabajo se encuentra orientado al estudio de: a) los rearreglos del gen C-MYC, tendiente a definir el tipo de desbalance presente y sus niveles de transcripto; b) Analizar la presencia de deleciones y/o mutaciones de CD27 y sus niveles de expresión génica; c) correlacionar estos datos con los parámetros clínicos de la patología y estimar la utilidad pronóstica de estos marcadores. Metodología: Las muestras de médula ósea (MO) anticoaguladas con EDTA y heparina fueron obtenidas por el médico hematólogo con la conformidad y el consentimiento informado de los pacientes.
Se analizaron un total de 20 muestras de pacientes (10 con MM y 10 con MGUS). Se efectuó cultivo directo de 72 hs para el análisis citogenético y citomolecular usando las sondas TP53, C-MYC y CD27 (Live-Lexel). Para la búsqueda de rearreglos y mutaciones puntuales se efectuó extracción de ADN, por el método fenol-cloroformo y trizol para ARN. Para la cuantificación de los niveles de expresión génica de C-MYC y CD27 se extrajo ARN y se obtuvo ADN copy (ADNc) mediante RT-PCR. Para el diseño de primers para CD27, se usaron los programas Primers3 y Primer-BLAST para garantizar su especificidad. En el caso de C-MYC se utilizarán primers ya publicados y verificados en el presente trabajo.
Resultados: De todos los cultivos de MO realizados se obtuvo material apto para su análisis citogenético. Se evaluaron 10 muestras de pacientes con MGUS que fueron tomadas como controles, usando las sondas de FISH C-MYC y CD27, a fin de establecer el punto de corte para cada una de ellas. Sobre las muestras con MM, se usó la sonda TP53 detectando que 9 de las 10 muestras presentaban deleción de dicho locus, a la vez que se prevé analizar también el status de C-MYC y CD27 mediante FISH. Se logró poner a punto la extracción de ácidos nucleicos en dichas muestras y la obtención de ADNc a partir de ARN. Los primers diseñados se detallan a continuación. Promotor CD27 Fwr 5´-TAATACTCTCCCCAGCACACGGA-3´ y Rev 5´-CTTTCTGTG CCCAGTTGCTGATG-3´, Exón 1y2 Fwr 5´-C TAACTCCAGAGG CCAGCATCA-3´, Exón 2 Rev 5´-CACACTGAGCAGCCTTTC TATG-3´ y Exón 3 Rev 5´-CGAAGGGTTTGGAAGAGGATCA-3´. MYC Exón 2 Fwr 5´-ACCACCAGCAGCGACTCTGA-3´; MYC Exón 2 Rev 5´-TCCAGCAGAAGGTGATCCAGACT-3´.
Conclusiones: La evaluación de dichos resultados en relación con los factores pronóstico y la evolución clínica de los pacientes, permitirá delinear las características específicas de estas entidades y lograr una mayor comprensión de los mecanismos patogénicos implicados en el desarrollo de las mismas.
Palabras clave: MIELOMA, MGUS, C-MYC, CD27
Abreviaturas: MM: mieloma múltiple; MGUS: gammapatía monoclonal de significado incierto; MO: médula ósea. ADNc: ADN copy. Fwr: forward; Rev: reverse.